撰文
言笑
#神经退行性疾病#种类多样，但他们拥有同一个特征——功能性神经元丢失。近年来，细胞重编程获得蓬勃发展，将常驻神经胶质细胞在体内转化为功能性神经元（glia-to-neuron）成了一种非常有前景的神经再生策略。因此，科学家们花费了巨大的努力来探究如何将内源性的胶质细胞转分化为功能性的神经元，以此来弥补疾病中那些受损伤或丢失神经元的功能。实现glia-to-neuron有很多策略：在胶质细胞中通过病毒载体过表达一些可以促进胶质细胞转化为神经元的基因，包括一些转录因子和miRNA，或者通过基因或小分子介导的方法修饰胞外信号通路。这些方法的成功率参差不齐：有的只在体外或不成熟的胶质中发挥作用，有的只能实现部分重新编程或不能诱导产生所需的神经元类型。这些方法还存在一个明显的缺陷，那就是没有直接证据显示重新编程的胶质细胞和新生神经元之间的血统（谱系）关系。
Glia-to-neuron领域中的重大进展莫过于通过操纵单个因子来可靠和高效地实现体内胶质重编程。其中最具代表性的是通过AAV载体过表达NeuroD1或敲低Ptbp1实现“体内glia-to-neuron转分化”。这些诱导产生的神经元在形态、电生理特性、组织排列等方面与内源性神经元非常类似。在小鼠中采用这种策略可以有效改善脑中风、帕金森综合症、亨廷顿舞蹈症等疾病中的行为或病理学缺陷，并有望应用于治疗人类神经疾病。
在如此重大的研究突破面前，科学家们并没有被冲昏头脑，依旧有团队在思考“这些近乎完美的神经元是否真的来源于胶质细胞转分化”。他们认为这种简单而优雅的功能丧失方法确实可以解决与以前定向胶质重编程相关的许多困难，例如重编程效率低、过度表达载体过于复杂等。然而，仍有几个主要问题有待解决：首先，目前的这些数据都不能直接证明Ptbp1在胶质细胞原位的表达减少；其次，之前的研究中主要根据GFAP启动子的AAV载体或转基因来推断胶质细胞和神经元之间的谱系关系，但这种方法并不严谨，因为已经有研究显示，在某些情况下基于GFAP启动子的表达载体也会在神经元中表达；第三，缺乏可靠的遗传谱系分析和/或基于scRNA-Seq的轨迹分析来直接证明胶质到神经元的转分化。因此，在将Ptbp1敲低诱导神经元这一方法应用到临床之前，这些问题都必须阐释清楚。
然而，明天和意外，你永远都不知道哪一个会先到来。当大家都在翘首企盼Ptbp1相关重编程策略应用于人类神经疾病治疗时，来自得克萨斯大学西南医学中心的张春立团队和来自美国约翰霍普金斯大学医学院的SethBlackshaw团队相继发文，对NeuroD1或Ptbp1相关的glia-to-neuron转分化研究提出质疑。张春立团队于年9月27日在Cell上发表了题为Revisitingastrocytetoneuronconversionwithlineagetracinginvivo的研究论文（详见Bioart报道：Cell丨挑战整个领域！张春立团队运用谱系追踪法重新审视小鼠体内胶质细胞向神经元转分化现象）。该研究运用谱系追踪法系统性地证明了过表达NeuroD1或敲低Ptbp1并不能把体内星形胶质细胞转分化为神经元。那些所谓的“新生神经元”只不过是大脑本身的原位神经元。随后，年10月5日，SethBlackshaw团队在BioRxiv上在线发表了题为Ptbp1deletiondoesnotinduceglia-to-neuronconversioninadultmouseretinaandbrain的文章（本报道将详细解读该文章）。研究人员采用严格的谱系示踪系统结合scRNA-seq及电生理发现，在视网膜穆勒胶质细胞（retinalMllerglia）或大脑星形胶质细胞（Astrocytes）中特异性地敲低或敲除Ptbp1并不能观察到glia-to-neuron转分化现象。
首先，作者评估了Ptbp1敲除在视网膜细胞中的功能。为了在视网膜Mllerglia中同时干扰Ptbp1并可视化地标记这些细胞，作者采用了3种转基因小鼠品系：GlastCreERT2,tamoxifen处理后，选择性地诱导Mllerglia中的Cre-依赖性重组；Sun1-GFPlox/lox,Cre活化后在CAG启动子的驱动下表达靶向核膜的GFP；Ptbp1lox/lox,loxP位点侧面插入了Ptbp1的启动子和第一个外显子编码序列，Cre激活后，会扰乱其转录。通过交配产生用于后续实验3种基因型小鼠（图1A）：野生型（GlastCreERT2;Sun1-GFPlox/lox;Ptbp1+/+）、Ptbp1杂合敲除（GlastCreERT2;Sun1-GFPlox/lox;Ptbp1lox/+）、Ptbp1纯合敲除（GlastCreERT2;Sun1-GFPlox/lox;Ptbp1lox/lox）。在成年野生型小鼠的视网膜细胞中，PTBP1蛋白主要富集在Mllerglia中。Ptbp1纯合敲除小鼠中，PTBP1阳性的Mllerglia数量减少了约90%（图1B-C），但GFP阳性的Mllerglia数量并没有明显变化，提示它们并没有生成视网膜神经节细胞或者光感受体。为了确认该结果，作者检测了神经节细胞特异性标志物RBPMS和BRN3B。在Ptbp1敲除之后，RBPMS和BRN3B与GFP并没有任何共定位（图1D）。同样地，GFP与视锥神经元标志物arrestin或感光受体标志物OTX2也不存在共定位现象（图1E）。之前也有研究显示，Ptbp1敲除后会使Mllerglia转分化为视网膜神经节细胞，可以有效缓解由于NMDA兴奋性毒性损伤引起的视觉缺陷。作者发现，虽然NMDA处理之后，RBPMS阳性视网膜神经节细胞丢失增多，但并没有观察到任何GFP/RBPMS或GFP/BRN3B阳性细胞，或视网膜神经节细胞的恢复。这些结果表明，Ptbp1缺失之后，无论在正常的还是损伤的视网膜中，都不能将Mllerglia转化为视网膜神经元。
图1.Ptbp1敲除不能诱导视网膜Mllerglia转分化为神经元
随后，作者在大脑星形胶质细胞（Astrocytes）中进行了相关探究。实验中使用了3个小鼠品系分别为：tamoxifen诱导型Aldh1l1CreERT2小鼠，Sun1-GFPlox/lox和Ptbp1lox/lox小鼠。通过交配获得了野生型，Ptbp1在星形胶质细胞中杂合或纯合敲除的小鼠。之前的研究发现，在皮层、纹状体和黑质中敲低Ptbp1能有效地将Astrocytes转化为神经元，因此作者主要针对这3个脑区进行后续分析。在Ptbp1缺失小鼠中没有观察到任何GFP与神经元标志物NeuN和HuC/D的共定位。通过全细胞膜片钳实验，作者发现在Ptbp1杂合或纯合敲除小鼠的皮层中，GFP阳性Astrocytes并不会产生动作电位，相反邻近的GFP阴性野生型神经元具有产生动作电位的能力，说明Ptbp1缺失之后Astrocytes的生理特性并没有改变。这些实验结果说明Astrocytes中Ptbp1敲除之后不能引起任何特异性的类似神经元的电生理变化。
最后，由于之前的研究并没有分析过胶质细胞中Ptbp1敲低之后的基因表达谱。为了全面剖析在Müllerglia和Astrocytes中敲除Ptbp1后所引起的细胞表型，作者采用scRNA-Seq分析了野生型、杂合及纯合小鼠的视网膜、皮层、纹状体和黑质组织的基因表达谱。在所有的组织中，Ptbp1表达水平均降低，但在胶质细胞群中没有观察到明显的基因表达的改变，同时也没有观察到Müllerglia特异性标记基因的显著性降低（包括Sox9,Glul,Rlbp1,Slc1a3,Apoe,Aqp4,Mlc1,Kcnj10和Tcf7l2），或者诱导出任何神经组细胞或成熟神经元的特异性标记基因。免疫染色证明Ptbp1缺失Müllerglia依旧表达胶质细胞标记基因SOX9。与Müllerglia类似，Astrocytes中Ptbp1敲除之后，只观察到了非常微妙的基因表达谱的变化。上调的基因包括mt-Nd4,Son,Hes5,Mt3；下调的基因包括mt-Nd3,Lars2,lvd。大多数Astrocytes的标记基因在Ptbp1敲除后并没有发生明显改变。免疫染色证实Ptbp1缺失的GFP阳性Astrocytes依旧表达胶质细胞标记基因SOX9，同时没有检测到任何神经组细胞或成熟神经元特异性基因的表达。
总的来说，该研究通过遗传缺失和细胞谱系分析，结合scRNA-Seq，作者在视网膜和脑组织中都没有获得任何数据来证实部分或完全敲除Ptbp1后可以诱导胶质细胞转分化为神经元。这些数据与之前使用ASO,shRNA和/或CasRx敲低Ptbp1的研究结论完全相反，与张春立团队的研究结论一致。再一次证明，先前关于glia-to-neuron转分化不太可能是由于胶质细胞中Ptbp1功能丧失造成的。那么，在NMDA兴奋性毒性造成损伤之后，视觉功能恢复的原因是什么？帕金森症小鼠模型中行为缺陷恢复的原因又是什么？作者认为一种可能是基于GFAP的试剂在内源性神经元中的异位表达；另一种可能是在以前的研究中针对Ptbp1的试剂的脱靶效应。作者强调不管是哪种情况，在将来的glia-to-neuron研究中都应该应用严格的谱系追踪对相关结论进行验证。
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