前言
糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病的一种严重并发症，目前是致盲的主要原因之一。研究表明大量活化的小胶质细胞和炎性巨噬细胞参与DR的发展。然而，由小胶质细胞/巨噬细胞驱动的适应性免疫炎症在DR中的作用尚不清楚。
Kdm6a负责去除组蛋白3赖氨酸27(H3k27)上的二甲基和三甲基基团，并激活靶基因转录。Kdm6a与小胶质细胞/巨噬细胞之间的关系以及Kdm6a导致糖尿病视网膜病变的分子机制尚不清楚。
近日，复旦大医院/医院韦严副研究员为通讯作者，在内分泌领域权威期刊Metabolism(IF:13.)在线发表了题为“Kdm6adeficiencyinmicroglia/macrophagesepigeneticallysilencesLcn2expressionandreducesphotoreceptordysfunctionindiabeticretinopathy”的研究论文，发现了糖尿病视网膜病变小胶质细胞/巨噬细胞中的Kdm6a通过控制Lcn2的表达抑制光感受器细胞的糖酵解过程。
研究结果
1、Kdm6a在糖尿病视网膜病变中上调碍
通过腹腔注射链脲佐菌素（STZ）建立了糖尿病小鼠模型（图1A-C），Kdm6a蛋白和mRNA表达在糖尿病视网膜中升高（图1D）。暴露于高糖条件下的小胶质细胞中Kdm6a表达也明显上调（图1E-G）。并且小胶质细胞/巨噬细胞中Kdm6a缺乏可能减轻DR诱导的视网膜功能丧失（图1H）。
图1
糖尿病小鼠视网膜中KDM6A的表达
2、Kdm6a敲降可以降低体内外糖尿病视网膜病变的炎症反应
与对照相比，Kdm6a条件敲除小鼠视网膜中蛋白Tnfα和iNos表达下调（图2A）。高糖条件下特异性敲降Kdm6a，可以导致BV2细胞中蛋白CD11b和CD86表达降低（图2B-C），Il1β、Tnfα、iNos、Il6mRNA表达降低（图2D）。特异性敲降Kdm6a，可以促进IL4刺激的BV2细胞表面的CD表达（图2F），促进Ym1、Il13、Il10、Arg1mRNA的表达（图2E）。以上结果表明，Kdm6a有助于DR中小胶质细胞/巨噬细胞的M1极化。
图2
小胶质细胞中KDM6A敲降在体内可以减轻糖尿病视网膜病变的炎症，在体外调节小胶质细胞的极化
3、高糖通过Kdm6a依赖性调节增强视网膜小胶质细胞/巨噬细胞中Lcn2的表达
接下来，对高糖条件下的小胶质细胞/巨噬细胞进行转录组测序。与对照相比，Lcn2是高糖刺激下上调为明显的分泌蛋白基因（图3A）。糖尿病小鼠模型中Lcn2的蛋白和mRNA表达也显著增加（图3B）。结果表明，在DR的小胶质细胞中Lcn2的表达增加。
图3
糖尿病小鼠小胶质细胞中LCN2的表达
对si-Kdm6a的BV2细胞进行转录组测序，结果显示Lcn2表达显著下调（图4A）。si-Kdm6a的BV2细胞中，高糖暴露诱导的Lcn2的表达并显著抑制（图4D）。无论细胞是否暴露于高糖，si-Kdm6a的BV2细胞上清中的Lcn2蛋白水平低于对照（图4E）；相反，在BV2细胞中过表达Kdm6a可以显著促进lcn2蛋白和mRNA的表达（图4F-G）。
由于Kdm6a作为针对H3k27me3的去甲基化酶发挥作用并上调靶基因，结果显示，Kdm6a敲降显著增加了Lcn2启动子区域H3k27me3甲基化水平（图4H），反之Kdm6a过表达降低了H3k27me3甲基化水平（图4I）。
以上结果表明，Kdm6a直接降低了Lcn2基因的H3k27me3修饰水平，并促进了Lcn2表达。
图4
Kdm6a对BV2细胞中Lcn2表达的影响
4、Lcn2通过抑制糖酵解而破坏感光细胞的功能
IRBP蛋白在视觉周期中起重要作用，对光感受器的维持至关重要；外周蛋白是视盘膜的组分之一。小鼠眼睛玻璃体腔注射重组Re-Lcn2，小鼠视网膜中IRBP和外周蛋白表达水平降低（图5C）。对Re-Lcn2处理的W细胞进行非靶向代谢组和转录组测序联合分析，结果显示Re-Lcn2主要抑制了细胞中糖酵解过程（图5F）。代谢组检测结果显示Re-Lcn2处理显著降低了细胞和培养基中乳酸水平（图5E,I）。
图5
Re-Lcn2通过阻断糖酵解进程损害感光细胞的细胞活力
收集高糖暴露的Lcn2敲降的BV2细胞培养基，并与W细胞孵育，结果显示sh-Lcn2可以抵抗高糖对W细胞的损伤（图6B），细胞的乳酸增加（图6D）。Kdm6a过表达的BV2细胞培养基与W细胞孵育，可以降低W细胞的存活率；而sh-Lcn2+OE-Kdm6a的BV2细胞培养基与W细胞孵育，可以恢复W细胞的活力（图6C），增加细胞的乳酸产生（图6G）。
以上表明，来自小胶质细胞/巨噬细胞的Lcn2的增加损害了感光细胞的糖酵解进程。
图6
BV2细胞中Lcn2的敲降促进了W细胞活性
5、小胶质细胞/巨噬细胞中的Kdm6a缺乏维持光感受器中正常的糖酵解过程
条件敲除小鼠IRBP和外周蛋白表达升高（图7A-B）。si-Kdm6aBV2细胞培养基与W细胞孵育（图7C），W细胞中IRBP蛋白表达水平显著上升（图7D），W细胞的存活率升高（图7E），细胞上清中乳酸含量增加（图7F）。Kdm6a敲除减弱了Re-Lcn2对W细胞中乳酸排泄的抑制作用（图7F）。暴露于Re-Lcn2的BV2细胞中Kdm6a敲降后，W细胞中糖酵解的主要酶活性的变化升高（图7I）。
以上结果表明，小胶质细胞/巨噬细胞中Kdm6a的缺失维持了光感受器的正常糖酵解，并减少了糖尿病视网膜病变的损害。
图7
KDM6A敲除降低糖尿病视网膜病变中感光细胞的功能障碍，并通过维持正常的糖酵解过程恢复感光细胞的活力
6、Kdm6a和Lcn2的减少直接改善糖尿病视网膜病变
接下来在体内研究Kdm6a和Lcn2的作用。将siRNA注射到小鼠玻璃体腔中以干扰Kdm6a和Lcn2表达，结果显示IRBP和周边蛋白表达升高（图8C-D），表明体内干扰Kdm6a和Lcn2可以改善糖尿病视网膜病变。
图8
通过玻璃体内注射siRNA降低Kdm6a和Lcn2的表达可以减轻糖尿病小鼠的视网膜病变
研究结论
本研究用条件敲除小鼠建立了糖尿病动物模型，以研究Kdm6a缺乏的影响。
结果显示，糖尿病小鼠视网膜中Kdm6a的表达增加。小胶质细胞/巨噬细胞中的Kdm6a以去甲基化酶活性依赖的方式调节Lcn2的表达，并通过Lcn2抑制光感受器细胞中的糖酵解进程。这些结果表明，小胶质细胞和巨噬细胞中的Kdm6a通过促进Lcn2表达和损害光感受者细胞中的糖解进程而加重糖尿病视网膜病变。
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